Sự khác biệt chính - PCR và QPCR

PCR (phản ứng chuỗi polymerase) và qPCR (PCR định lượng) là hai kỹ thuật được sử dụng trong công nghệ sinh học để khuếch đại DNA cho các mục đích khác nhau. PCR là một kỹ thuật tương đối đơn giản. qPCR còn được gọi là PCR thời gian thực hoặc PCR kỹ thuật số. Các Sự khác biệt chính giữa PCR và qPCR là PCR là một kỹ thuật định tính trong khi qPCR là một kỹ thuật định lượng. PCR cho phép đọc kết quả là "hiện diện hoặc vắng mặt". Nhưng trong qPCR, số lượng DNA được khuếch đại trong mỗi chu kỳ được định lượng. Nếu RNA được sử dụng trong PCR, kỹ thuật này được gọi là RT-PCR (PCR phiên mã ngược), và nếu RNA được sử dụng trong qPCR, kỹ thuật này được gọi là qRT-PC.

Các lĩnh vực chính được bao phủ

1. PCR là gì - Định nghĩa, Quy trình, Sử dụng 2. QPCR là gì - Định nghĩa, Quy trình, Sử dụng 3. Điểm giống nhau giữa PCR và QPCR - Sơ lược các tính năng chung 4. Sự khác biệt giữa PCR và QPCR - So sánh các điểm khác biệt chính

Thuật ngữ chính: Điện di trên gel Agarose, Khuếch đại, DNA polymerase, Thuốc nhuộm huỳnh quang, PCR, Đầu dò, qPCR, RT-qPCR

PCR là gì

PCR đề cập đến một kỹ thuật trong công nghệ sinh học cho phép phân tích một chuỗi DNA ngắn bằng cách khuếch đại một đoạn DNA đã chọn. Đây tương đối là một phương pháp nhạy cảm vì một phản ứng cần thể tích rất nhỏ. Kỹ thuật này dựa trên khả năng của DNA polymerase để tổng hợp các chuỗi DNA mới vào chuỗi khuôn mẫu được cung cấp theo cách bổ sung. Hỗn hợp phản ứng của PCR bao gồm DNA polymerase, DNA nucleotide, mồi, khuôn mẫu DNA được khuếch đại và magiê. Việc khuếch đại được thực hiện bên trong một bộ quay vòng nhiệt. DNA polymerase nên bền với nhiệt vì nhiệt độ cao được sử dụng trong phản ứng này. Hai loại DNA polymerase được sử dụng trong PCR là Taq DNA polymerase và Pfu DNA polymerase. Taq DNA polymerase được sử dụng rộng rãi trong PCR.

DNA polymerase yêu cầu một sợi DNA có sẵn ở đầu 3 ′ để tổng hợp một sợi mới. Do đó, một đoạn mồi oligonucleotide được thêm vào hỗn hợp phản ứng để bắt đầu tổng hợp DNA. Yêu cầu của mồi trong PCR chỉ cho phép khuếch đại một vùng cụ thể trong tiêu bản. Trình tự mục tiêu được bao bọc bởi các cặp mồi thuận và nghịch. Khi kết thúc PCR, các bản sao mới của một chuỗi DNA cụ thể, được gọi là amplicon, được tích lũy hàng tỷ. Các thành phần của PCR nên được tối ưu hóa theo cách để cải thiện hiệu suất PCR trong khi giảm thiểu sự cố. Phản ứng PCR tiêu chuẩn được thể hiện trong hình 1.

Hình 1: PCR

Các bước của PCR

Ba bước của một PCR được mô tả dưới đây.

1. Biến tính - Khuôn mẫu DNA sợi kép được tách thành hai sợi đơn bằng cách đun nóng đến 94-95 ° C.
2. Ủ - Các đoạn mồi thuận và nghịch liên kết với các trình tự bổ sung trong tiêu bản. Nhiệt độ phụ thuộc vào nhiệt độ nóng chảy của tổ hợp mồi.
3. Phần mở rộng mồi - Enzyme DNA polymerase mở rộng từng đoạn mồi ở đầu 3’của chúng bằng cách thêm bazơ bổ sung vào sợi đang phát triển. Nhiệt độ tối ưu của Taq polymerase, tức là 72 ° C, được sử dụng làm nhiệt độ trong bước mở rộng. Thời gian kéo dài phụ thuộc vào số lượng cặp bazơ trong sợi tiêu bản.

Ba bước được lặp lại trong 28-35 lần. Điện di trên gel agarose được sử dụng trong phân đoạn kích thước của sản phẩm PCR. Sản phẩm được nhuộm bằng ethidium bromide và được quan sát dưới tia cực tím. Sản phẩm PCR hoặc DNA khuếch đại có thể được sử dụng trong nhân bản, giải trình tự hoặc định dạng kiểu gen.

QPCR là gì

QPCR đề cập đến một kỹ thuật trong công nghệ sinh học cho phép phát hiện, xác định đặc tính và định lượng axit nucleic cho các ứng dụng khác nhau. Do đó, nó là một loại PCR định lượng. Cả DNA và RNA đều có thể được sử dụng làm qPCR. Nếu RNA được sử dụng làm khuôn mẫu, trước tiên nó phải được phiên mã ngược thành cDNA. Do đó, loại qPCR này được gọi là RT-qPCR. PCR truyền thống được thực hiện đối với cDNA hoặc mẫu DNA thông thường. Tuy nhiên, trong qPCR, thuốc nhuộm huỳnh quang được sử dụng để ghi nhãn sản phẩm PCR trong mỗi bước của chu trình PCR. Điều này cho phép thu thập dữ liệu khi PCR tiến triển, cho phép định lượng amplicon trong giai đoạn theo cấp số nhân của PCR. Loại thuốc nhuộm chính được sử dụng trong qPCR là SYBR Green. Thuốc nhuộm liên kết với DNA sợi đôi. Khi độ huỳnh quang tăng lên tương ứng với lượng DNA được khuếch đại, việc định lượng có thể được thực hiện trong “thời gian thực”. Nhược điểm chính của việc sử dụng thuốc nhuộm là nó cho phép định lượng một sản phẩm cụ thể trong mẫu. Ngoài thuốc nhuộm, đầu dò cũng có thể được sử dụng trong quá trình định lượng. Đầu dò TaqMan là một trong những loại đầu dò oligonucleotide chính được sử dụng trong qPCR, và quá trình phát xạ huỳnh quang được thể hiện trong hình 2.

Hình 2: TaqMan Probe

Đầu dò có thể được thiết kế theo cách để phát hiện một số sản phẩm PCR trong cùng một mẫu. Đầu dò TaqMan là một trong những loại đầu dò thủy phân chính; sự kết hợp của đầu dò này vào sản phẩm PCR làm bộc lộ chất fluorophore, phát ra huỳnh quang. Thuốc nhuộm huỳnh quang đặc hiệu hơn đối với sản phẩm PCR. Do đó, chúng được sử dụng trong hầu hết các xét nghiệm chẩn đoán để phát hiện sản phẩm PCR.

Điểm giống nhau giữa PCR và QPCR

Sự khác biệt giữa PCR và QPCR

Sự định nghĩa

PCR: PCR là một kỹ thuật trong công nghệ sinh học cho phép phân tích một chuỗi DNA ngắn bằng cách khuếch đại một đoạn DNA đã chọn.

QPCR: QPCR là một kỹ thuật trong công nghệ sinh học cho phép phát hiện, xác định đặc tính và định lượng axit nucleic cho các ứng dụng khác nhau.

Định tính định lượng

PCR: PCR là kỹ thuật định tính.

QPCR: QPCR là một kỹ thuật định lượng.

Phát hiện sản phẩm

PCR: Sản phẩm được phát hiện bằng điện di trên gel agarose trong PCR.

QPCR: Sản phẩm có thể được phát hiện trong mỗi chu kỳ khuếch đại trong qPCR.

Thu thập dữ liệu

PCR: Dữ liệu được thu thập vào cuối phản ứng trong PCR.

QPCR: Dữ liệu được thu thập trong giai đoạn hàm mũ của phản ứng trong qPCR.

Nghị quyết

PCR: PCR có độ phân giải rất kém.

QPCR: QPCR có độ phân giải rất cao.

Thuốc nhuộm

PCR: PCR sử dụng ethidium bromide để nhuộm sản phẩm trong quá trình PCR.

QPCR: QPCR sử dụng thuốc nhuộm huỳnh quang để phát hiện sản phẩm.

Thời gian

PCR: PCR là một phương pháp tốn nhiều thời gian hơn.

QPCR: QPCR ít tốn thời gian hơn.

RNA

PCR: RT-PCR là loại PCR sử dụng RNA làm khuôn mẫu.

QPCR: RT-qPCR là loại qPCR sử dụng RNA làm khuôn mẫu.

Vai diễn

PCR: PCR được sử dụng để phát hiện sự hiện diện hoặc vắng mặt của một số đoạn gen nhất định.

QPCR: QPCR được sử dụng để định lượng một đoạn cụ thể trong mẫu.

Phần kết luận

PCR và qPCR là hai loại kỹ thuật được sử dụng trong công nghệ sinh học để khuếch đại DNA cho các mục đích khác nhau. PCR là phương pháp khuếch đại truyền thống được sử dụng để xác định sự hiện diện hoặc không có của một đoạn DNA. QPCR được sử dụng để định lượng một đoạn cụ thể trong mẫu. Do đó, PCR là một kỹ thuật định tính trong khi qPCR là một kỹ thuật định lượng. Đây là sự khác biệt chính giữa PCR và qPCR.

Thẩm quyền giải quyết:

1. “QPCR so với PCR kỹ thuật số so với PCR truyền thống.” Thermo Fisher Scientific, Có sẵn tại đây.

Hình ảnh lịch sự:

1. “PCR” của Madprime - Tác phẩm riêng (CC BY-SA 3.0) qua Commons Wikimedia2. “Taqman” của Người dùng: Braindamaged - Tác phẩm của chính người tải lên ban đầu (Miền công khai) qua Commons Wikimedia