Sự khác biệt chính - PCR và RT-PCR

PCR và RT-PCR là hai kỹ thuật quan trọng trong sinh học phân tử. PCR được phát triển bởi Kary Mullis vào năm 1980. Nó có khả năng tăng số lượng bản sao của một gen cụ thể theo cấp số nhân, tạo điều kiện thuận lợi cho việc phát hiện đoạn ADN cụ thể đó. Taq Polymerase là enzym được sử dụng thường xuyên nhất trong hệ thống PCR. Nó là một loại enzym có thể điều nhiệt. Trong RT-PCR, phiên mã ngược được theo sau bởi PCR. Enzyme phiên mã ngược tham gia vào quá trình tổng hợp DNA bổ sung từ RNA. Các Sự khác biệt chính giữa PCR và RT-PCR là PCR sử dụng DNA sợi kép làm khuôn trong khi RT-PCR sử dụng RNA làm khuôn.

Các lĩnh vực chính được bao phủ

1. PCR là gì - Định nghĩa, Quy trình, Ứng dụng 2. RT PCR là gì - Định nghĩa, Đặc điểm, Ứng dụng 3. Sự khác biệt giữa PCR và RT PCR - So sánh các điểm khác biệt chính

Thuật ngữ chính: PCR, RT-PCR, Phản ứng chuỗi polymerase, Phản ứng chuỗi phiên mã ngược-Polymerase, Mẫu DNA, DNA Polymerase, Biến tính, Ủ, Mở rộng mồi

PCR là gì

PCR (Phản ứng chuỗi polymerase) là một phương pháp tương đối đơn giản nhưng mang tính cách mạng. PCR sử dụng khả năng của enzyme, DNA polymerase để tổng hợp chuỗi DNA mới theo cách bổ sung cho chuỗi khuôn mẫu được cung cấp. PCR là một kỹ thuật không thể thiếu được sử dụng trong cả phòng thí nghiệm lâm sàng và nghiên cứu để phân tích chức năng của gen, chẩn đoán và theo dõi các bệnh di truyền, nhân bản DNA, giải trình tự và khuếch đại DNA cổ đại. Khuôn mẫu DNA, nucleotide, mồi, và DNA polymerase là bốn thành phần chính của PCR. Các Mẫu DNA thường là DNA sợi đôi với trình tự đích cần được khuếch đại. Taq DNA polymerase được phân lập từ thủy sinh Thermus thường được sử dụng trong PCR. Các Pfu DNA polymerase là một loại DNA polymerase khác có độ trung thực cao. Cả Taq và Pfu polymerase đều có khả năng chịu nhiệt. Các nucleotide được bổ sung bởi DNA polymerase là adenine (A), guanine (G), cytosine (C) và thymine (T). Vì DNA polymerase chỉ có thể thêm một nucleotide mới vào đầu 3 ′ của sợi DNA đã có từ trước, nên cần có một đoạn mồi oligonucleotide để bắt đầu tổng hợp DNA. Yêu cầu của mồi trong PCR chỉ cho phép khoanh vùng một vùng cụ thể trong tiêu bản. Trình tự mục tiêu được bao bọc bởi các cặp mồi thuận và nghịch. Khi kết thúc PCR, các bản sao mới được gọi là amplicon của một trình tự DNA cụ thể được tích lũy hàng tỷ. Các thành phần của PCR nên được tối ưu hóa theo cách để cải thiện hiệu suất PCR trong khi giảm thiểu sự cố.

PCR là một quá trình tự động được thực hiện bởi các chu trình nhiệt, có khả năng chuyển đổi giữa các nhiệt độ khác nhau. PCR là một quá trình gồm ba bước.

1. Biến tính - Khuôn mẫu DNA sợi kép được tách thành hai sợi đơn bằng cách đun nóng đến 94-95 ° C.
2. Ủ - Các đoạn mồi thuận và nghịch liên kết với các trình tự bổ sung trong tiêu bản. Nhiệt độ của bước này phụ thuộc vào nhiệt độ nóng chảy của tổ hợp sơn lót.
3. Phần mở rộng mồi - Enzyme DNA polymerase mở rộng từng đoạn mồi ở đầu 3 của chúng bằng cách thêm bazơ bổ sung vào sợi đang phát triển. Nhiệt độ tối ưu của Taq polymerase, 72 ° C được sử dụng làm nhiệt độ trong bước mở rộng. Thời gian kéo dài phụ thuộc vào số lượng cặp bazơ trong sợi tiêu bản.

Ba bước được lặp lại trong 28-35 lần.

Hình 1: Phản ứng chuỗi polymerase

Các sản phẩm của PCR được phân đoạn kích thước bằng điện di trên gel agarose so với thang DNA. Hình ảnh DNA trên gel agarose được thực hiện bằng cách nhuộm với ethidium bromide và quan sát dưới tia cực tím. Các dải DNA được khuếch đại dưới tia cực tím trong gel nhuộm ethidium bromide được thể hiện trong hình 2. Thang DNA được hiển thị ở giếng ngoài cùng bên trái.

Hình 2: Các dải DNA

RT-PCR là gì

RT-PCR (Phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược) là một trong những kỹ thuật nhạy cảm nhất được sử dụng để phát hiện mRNA. RNA là khuôn mẫu thích hợp để thu thập thông tin về biểu hiện gen của mô bình thường hoặc biểu hiện gen của mô bị nhiễm bệnh. Khuôn mẫu cho RT-PCR có thể là RNA tổng số hoặc RNA của vi rút hoặc vi khuẩn. RNA được phiên mã ngược thành DNA bổ sung (cDNA) bởi enzyme, enzyme phiên mã ngược. Nhiệt độ tối ưu của men sao chép ngược là 46 ° C. CDNA được sử dụng trong PCR để thu được sản phẩm. Các bước trong PCR phiên mã ngược được thể hiện trong hình 3.

Hình 3: RT-PCR

RT-PCR có thể được thực hiện theo phản ứng hai bước hoặc một bước. Trong phản ứng hai bước, quá trình phiên mã ngược và PCR được thực hiện theo hai bước riêng biệt. Trong RT-PCR một bước, phiên mã ngược được theo sau bởi PCR trong một ống đơn theo cách thức tuần tự. Cả cDNA và sản phẩm PCR cuối cùng đều có thể chạy trên gel agarose cho các mục đích phân đoạn kích thước và hình dung. RT-PCR một bước và hai bước được thể hiện trong hình 4.

Hình 4: RT-PCR một bước và hai bước

Sự khác biệt giữa PCR và RT-PCR

Sự định nghĩa

PCR: PCR là một kỹ thuật được sử dụng trong sinh học phân tử để khuếch đại một đoạn DNA tạo ra hàng triệu bản sao của một chuỗi DNA.

RT-PCR: RT-PCR là một biến thể của PCR được sử dụng để phát hiện biểu hiện gen trong sinh học phân tử.

Các bước

PCR: Biến tính, ủ và mở rộng là ba bước trong PCR.

RT-PCR: Trong RT-PCR, phiên mã ngược được theo sau bởi PCR.

Bản mẫu

PCR: Một phân tử DNA sợi đôi đóng vai trò là khuôn mẫu cho PCR.

RT-PCR: Một phân tử ARN sợi đơn đóng vai trò là khuôn mẫu cho quá trình phiên mã ngược. Một phân tử DNA sợi đơn đóng vai trò là khuôn mẫu cho PCR.

Enzyme được sử dụng

PCR: DNA polymerase được sử dụng làm enzyme trong PCR.

RT-PCR: Enzyme phiên mã ngược và DNA polymerase được sử dụng làm enzyme trong RT-PCR.

Sơn lót

PCR: Các mồi thuận và ngược được sử dụng trong PCR.

RT-PCR: Chỉ có đoạn mồi ngược được sử dụng cho quá trình phiên mã ngược và cả cặp mồi thuận và ngược đều được sử dụng trong PCR.

Nhạy cảm

PCR: PCR là một phương pháp nhạy cảm.

RT-PCR: RT-PCR nhạy hơn PCR đó.

Các ứng dụng

PCR: PCR được sử dụng trong phân tích chức năng của gen, chẩn đoán và theo dõi các bệnh di truyền, nhân bản DNA, giải trình tự DNA và khuếch đại DNA cổ đại.

RT-PCR: RT-PCR được sử dụng để phát hiện biểu hiện gen.

Phần kết luận

PCR và RT-PCR là hai kỹ thuật quan trọng được sử dụng trong sinh học phân tử. Cả PCR và RT-PCR đều là các kỹ thuật tự động có khả năng tăng số lượng bản sao của chuỗi DNA mục tiêu theo cấp số nhân, được xác định bởi các đoạn mồi thuận và nghịch. Trong PCR, DNA sợi đôi được sử dụng làm khuôn mẫu. Bằng PCR, nhân bản DNA, giải trình tự DNA và phân tích chức năng của các gen có thể được thực hiện. Trong RT-PCR, biểu hiện gen trong một mô cụ thể có thể được quan sát bằng cách khuếch đại RNA. Sự khác biệt chính giữa PCR và RT-PCR là ở các mẫu được sử dụng trong từng phản ứng và ứng dụng của chúng.

Thẩm quyền giải quyết:

1. "Phản ứng chuỗi polymerase (PCR)." Trung tâm Thông tin Công nghệ Sinh học Quốc gia. Thư viện Y khoa Quốc gia Hoa Kỳ, n.d. Web. Có sẵn ở đây. Ngày 01 tháng 6 năm 2017. 2. "Phản ứng chuỗi polymerase (hoặc PCR)." Nhân bản và phân tích phân tử của gen. N.p., n.d. Web. Có sẵn ở đây. Ngày 01 tháng 6 năm 2017. 3. Biolabs, New England. “Tổng hợp CDNA & RT-PCR.” Tổng hợp CDNA & RT-PCR | NEB. N.p., n.d. Web. Có sẵn ở đây. Ngày 1 tháng 6 năm 2017.

Hình ảnh lịch sự:

1. “Phản ứng chuỗi polymerase” của Enzoklop - Tác phẩm riêng (CC BY-SA 3.0) qua Commons Wikimedia 2. “DNA fragmendid etiidiumbromiidiga värvitud agaroosgeelis.” Tác giả Rainis Venta - Tác phẩm riêng (CC BY-SA 3.0) qua Commons Wikimedia 3. “Phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược” Tác giả Jpark623 - Tác phẩm riêng (CC BY-SA 3.0) qua Commons Wikimedia 4. “Một bước so với hai bước RT-PCR ”của Jpark623 - Tác phẩm riêng (CC BY-SA 3.0) qua Commons Wikimedia